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分子生物学诊断技术概述

Deptember
2024-07-19 / 0 评论 / 0 点赞 / 13 阅读 / 9628 字

分子生物学诊断技术概述

原文:https://www.cmde.org.cn/splt/ltwz/lttwyq/20240719103236130.html
发布时间:2024-07-19
版权归属原文

(中国器审 2024年07月18日)

  检验医学是医学的重要组成部分,为临床对疾病预防、诊断、治疗和预后判断等提供重要信息。随着医学技术和医疗设备的不断发展,分子诊断学技术在检验医学中的应用越来越广泛。分子诊断学是利用分子生物学理论、技术和方法来研究人体内源性或外源性生物大分子及其体系的存在与否及其结构或表达调控的变化,为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据,从而为个体化医疗提供数据支持。

  经过多年的发展,分子诊断学技术主要分为分子杂交技术、PCR技术、以及基因测序技术等。由于分子诊断学技术在疾病诊断方面有快速、准确的优点,其在检验医学中具有重要地位。

  一、 基于核酸分子杂交技术的检测技术

  核酸分子杂交技术是指不同来源的2条核酸单链,在一定条件下,按照碱基互补配对原则形成双链的技术,主要包括荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)、菌落原位杂交技术、Northern印迹法、斑点杂交技术、芯片杂交技术、Southern 印迹法等。其中,FISH技术指在人体的染色体、组织或者细胞上,将荧光素标记的探针按照碱基互补配对原则,使得靶基因得以显示。

  FISH技术自问世以来,被迅速应用于检测各种类型的细胞遗传学的改变,包括染色体拷贝数异常、复制、扩增、缺失、倒位和易位等。同时,它也是临床疾病诊断的重要手段,如肿瘤检测、对染色体非整倍性异常引起的不孕不育检测等。美国医学遗传学学会于1993年发布了应用FISH进行产前诊断的相关说明,FISH技术在我国也应用于临床多年,主要应用于癌症辅助诊断、产前诊断等领域等。FISH技术在产前诊断领域作为核型分析技术的补充已成为专家共识。现批准上市产品有HER-2基因扩增检测试剂盒、ALK基因重排检测试剂盒、PML/RARα融合基因检测试剂盒、13/16/18/21/22/X/Y染色体数目检测试剂盒等。

  基因芯片是利用原位合成或者显微点样技术,将很多DNA探针按照顺序固定在支持物的表面,然后与进行标记的样本进行杂交,并且将杂交后获取的信号进行分析,从而能够获得样品的基因排列顺序和基因表达等信息。根据不同的基因芯片制作方法,基因芯片可以被分为两大类,一类是原位合成的芯片,另一类是DNA微阵列。根据基因芯片上探针的种类的不同,基因芯片还可以称作是寡核苷酸芯片、cDNA芯片、DNA芯片等。具有高密度特性的寡核苷酸芯片,主要采用的方法就是原位合成,具有低密度特性的芯片采用的是点样方法,而cDNA芯片和DNA芯片只能采用点样的方法制成。由于基因芯片技术具有自动化程度高、操作简单、通量高等特点,在基因分型、基因表达、单核苷酸多态性检测等方面均有广泛应用。现批准上市产品有葡萄糖6磷酸脱氢酶基因突变检测试剂盒(基因芯片法)、人乳头瘤病毒分型检测试剂盒(基因芯片法)、人乳头瘤病毒(20个型)基因分型检测试剂盒(PCR-电化学基因芯片法)、电化学基因芯片检测仪等。

  二、 基于PCR技术的检测技术

  聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction,PCR),是以DNA半保留复制机制为基础,发展出的体外酶促合成、扩增特定核酸片段的一种方法,包括变性-退火-延伸三个基本反应步骤。PCR技术由于具有速度快、操作方便、灵敏度高、标本要求低以及特异性高等特点,在食品检验、医学、农学等领域均得到广泛应用。随着技术的发展,除常规聚合酶链反应技术外,PCR技术已经衍生出很多不同的细分技术,例如实时荧光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR) 、逆转录PCR(Reverse transcription PCR(RT-PCR)、逆转录实时荧光定量PCR(Real-time quantitative RT-PCR,real-time RT-PCR(或RT-qPCR))、数字PCR( digitalPCR,dPCR) 、多重PCR(Multiplex Polymerase Chain Reaction,mPCR)也称复合PCR、反向PCR(Inverse-PCR)等;恒温扩增的技术还可以细分很多如LAMP、RPA、RCA、CPA、SDA和HDA。

  按照PCR技术的演进,人们习惯性的将PCR技术划分为三代:普通PCR技术,实时荧光定量PCR技术(qPCR)和数字PCR技术(dPCR)。普通PCR技术是经典方法,国际和国内标准齐全;仪器试剂成本较低,用于定性分析;qPCR技术具有方法成熟,配套仪器试剂齐全,试剂成本中等,操作简单,检测敏感性高,特异性高,可实现半定量检测;dPCR技术可以实现绝对定量,具有更高的敏感性和特异性,可以检测低拷贝样品,但dPCR技术所用到的仪器设备和试剂昂贵,操作复杂,检测时间长。目前三代的PCR技术各有各的优缺点,也各有各的应用领域,并不是一代取代一代的关系。技术的不断进步给PCR技术注入了新的活力,使其能解锁一个又一个的应用方向,使核酸检测更方便、更准确。

  PCR技术在临床检测中主要用于癌基因的检测和诊断及用药指导、致病病原体的检测、遗传病的产前诊断等方面。PCR技术在临床检测中被广泛应用,技术扩展性强。现批准上市产品有人乳头瘤病毒(HPV)核酸检测及基因分型试剂盒(PCR毛细电泳片段分析法)、人SHOX2、RASSF1A基因甲基化DNA检测试剂盒(PCR荧光法)、α-地中海贫血基因检测试剂盒(Gap-PCR法)、耳聋易感基因检测试剂盒(PCR+导流杂交法)、KRAS基因突变检测试剂盒(TaqMan熔解曲线荧光PCR法)、人Y染色体AZF区微缺失核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)、淋球菌/沙眼衣原体/解脲脲原体检测试剂盒(PCR+膜杂交法)、淋球菌/沙眼衣原体/解脲脲原体检测试剂盒(PCR+膜杂交法)、MTHFR C677T基因检测试剂盒(PCR-金磁微粒层析法)、人类EGFR突变基因检测试剂盒(多重荧光PCR法)、BMPR1A/PLAC8基因甲基化检测试剂盒(数字PCR法)等。

  三、 基于基因测序技术的检测技术

  基因测序就是通过各种测序技术把基因的序列测出来,进而通过生物信息学分析对这些不同的序列进行解读,1977年由Sanger发明的DNA双脱氧链末端终止测序法,也被称作“Sanger法”,这就是第一代基因测序技术,早在2001年完成的人类基因组框图,采用的就是该方法。该技术直到现在依然被广泛使用,但是其一次只能获得一条长度在700~1000个碱基的序列,无法满足现代科学发展对生物基因序列获取的迫切需求。经过不断的技术开发和改进,以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa和Hiseq技术及ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。第二代测序技术也称高通量测序(high-throughputsequencing,HTS)技术,也被称为新一代测序 (Next Generation Sequencing, NGS),是临床检测的主力军,相对于一代测序,它可以实现大规模平行测序,其具备检测用时短、灵敏度高、通量高、经济等诸多优势,极大地推动了分子诊断在临床检测方面的应用,也推进了基因组学的发展。第三代测序技术主要是以单分子测序及纳米孔测序为代表,如牛津大学的纳米测序技术(Oxford Nanopore' s nanopore sequencing),Pacific Biosciences公司的单分子实时技术(Single molecule real time, SMRT)等。与前两代相比,第三代测序技术的最大特点就是单分子测序,测序过程无需进行PCR扩增。

  目前,临床用第二代测序技术(NGS)已经商业化,并逐渐走向成熟,国内外许多公司正积极开发和商业化更多临床实验室的应用产品。NGS在临床应用中的仪器设备复杂,检测试剂需要根据不同检测方法配制,操作技术难度较大,对操作人员技术能力要求高,对结果解释的临床水平要求也非常高。第三代测序较第二代测序将读长提升了万倍,需克服错误率、成本及样本要求较高以及算法、软件、数据库等配套的技术问题。第一代基因测序技术因成本高、通量低而限制了其在临床方面的应用,但由于它的准确率极高,因而被认为是基因测序的“金标准”。未来基因测序技术发展方向:更快的序列获取速度;更准确的碱基识别方式;更长的单条测序序列长度;更轻便的测序仪器平台;更简便的操作过程;更便宜的测序价格。

  基因测序技术是先对基因采取片段化的方式,并在此基础上构建基因文库,然后将基因文库和载体相交联,与此同时使其扩增,实现在载体上合成的同时,能够对数量庞大的数据进行测序。基因测序技术近年来发展很快,应用日益广泛,在临床上主要应用于寻找疾病的候选基因,可用于单基因病、复杂疾病(如糖尿病、肥胖症等)甚至癌症致病基因或易感基因的寻找。同时,极大地促进了胎儿游离DNA的实验室研究和无创性产前基因诊断的发展。现批准上市的产品有:人类9基因突变联合检测试剂盒(可逆末端终止测序法)、呼吸道病原体核酸检测试剂盒(可逆末端终止测序法)、染色体非整倍体检测试剂盒(联合探针锚定聚合测序法)、基因测序仪等。

  四、 基于核酸质谱技术的检测技术

  20世纪80年代出现的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)打破了以往质谱仅可进行小分子物质分析的传统,使得核酸、蛋白质等生物大分子也可应用质谱进行研究,极大推进了基因组学、蛋白质组学的发展,并且给生物领域及医学领域带来了革命性的突破。核酸质谱,顾名思义是一种能检测核酸的质谱技术,它是基于MALDI-TOF MS质谱发展起来的一种多重PCR分析检测系统。

  质谱仪的核心构成部分主要包括进样系统、离子源、质量分析器与检测器。质谱仪器平台虽然种类众多,但可以通过样品进样方式、离子源、质量分析器等方面进行简易分类。质谱技术的基本原理是通过样品离子化,产生不同质荷比的离子,然后再经过质量分析器测定该样品中不同种类离子的分子量,并按照从小到大的顺序依次排列从而得到一幅质量图谱。由于核酸为极性、非易失性和热不稳定的生物大分子,且基于通量要求和样品制备的难度,目前核酸质谱主要使用的质谱技术为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionzation Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF-MS),其中MALDI为基质辅助激光解吸电离(matrix-assisted laser desorption ionization)的缩写,是一种软电离方式的离子源,给样品能量较小,容易获得能指明相对分子质量的准分子离子,基本不产生碎片峰;TOF-MS为飞行时间分析器(time of flight analyzer, TOF analyzer)其作用为将离子源产生的离子按m/z顺序分开并排列成谱。

  核酸质谱技术具有精准度高、特异性高、灵敏度高等特点,成本经济且高通量,可实现一次实验检测多个指标,既具有PCR技术的高敏感性、模板浓度要求低特点,又具备高分辨率和阵列技术的高通量等特点,且直接利用质谱峰值定性定量测定,无需化学发光、荧光法或其他任何二级标记方法,符合临床应用上的通量和灵敏度的需求。核酸质谱适合于复杂的、多靶标疾病的分子诊断,可应用于药物基因组学、病原体检测等领域。

  核酸质谱的主要特点是:PCR扩增后的产物,加入SNP序列特异延伸引物,在SNP位点上,延伸1个碱基。然后将制备的样品分析物与芯片基质共结晶,将该晶体放入质谱仪的真空管,而后用瞬时纳秒 (10-9s) 强激光激发,由于基质分子经辐射所吸收的能量,导致能量蓄积并迅速产热,从而使基质晶体升华,核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子,产生的离子多为单电荷离子,这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能,进而在一非电场漂移区内按照其质荷比率加以分离,在真空小管中飞行到达检测器。MALDI产生的离子常用飞行时间(Time-of-Flight,TOF)检测器来检测,离子质量越小,就越快到达。理论上讲,只要飞行管长度足够,TOF检测器可检测分子的质量数是没有上限的。现批准上市的产品有:二十项遗传性耳聋基因突变检测试剂盒(飞行时间质谱法)、人CYP2C19基因分型检测试剂盒(飞行时间质谱法)等。

  五、 基于CRISPR-Cas的检测技术

  CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌的一种适应性免疫应答系统,其通过体内小RNA对外来核酸进行序列特异性检测和沉默,从而阻止病毒、质粒等入侵。该系统发挥功能的过程主要包括适应、表达和干扰3个阶段。当病毒首次入侵时,细菌会将一小段病毒DNA整合到自身CRISPR基因的间隔序列中;当该病毒再次入侵时,之前整合的CRISPR转录生成成熟CRISPR序列,即crRNA,在crRNA引导下,Cas蛋白特异性识别并切割外源的基因组变为线性,使得病毒无法进行复制和表达,最终被细菌体内的酶降解。该现象最早被CRISPR先驱Jennifer Doudna和张锋报道。CRISPR/Cas系统由两大部分组成: 第一个部分是编码Cas相关蛋白质的基因,这些Cas蛋白在获得外源基因片段和剪切外源基因上都起着重要的作用。第二大部分被称为CRISPR array,这个部分中包含了repeat序列和spacer序列,这两种不同的序列是间隔开来的,本着两个repeat序列夹一个spacer序列,Repeat序列在同一细菌中的碱基组成和长度是相对保守,基本不变的。根据Cas效应蛋白的结构和功能,CRISPR/Cas系统被分为两大类: Class 1 (包含了type I, III, and IV), 和Class 2(包含了type II 和type V和type VI),在Class 1中, 对于外源基因组的剪切需要一个大的Cas蛋白复合物(由不止一种Cas蛋白组成)和引导RNA,在Class 2中, 对于外源基因的剪切只需要一个单一的剪切蛋白,目前基于CRISPR/Cas系统的检测方法包括RNA引导的靶向识别系统(Cas9),以及靶向识别触发的附带裂解系统(Cas12和Cas13)。根据检测原理, 可将这些基于CRISPR/Cas系统的核酸检测技术分为两类: 典型的靶向识别切割和非典型的非特异性反式切割。根据检测信号的方式主要包括四大类:基于荧光信号实时检测、基于裸眼比色检测、基于电化学检测和基于其他信号检测。其中较常用的为基于荧光信号的检测方法,即在反应体系中使用末端带有荧光基团和荧光猝灭基团标记的单链DNA或单链RNA报告基因,当Cas效应蛋白和crRNA复合物特异性识别切割目标基因后,会对报告基因进行非特异性切割,荧光素得以释放从而显示结果。准确、快速、简便、经济一直是IVD开发的目标,但就目前已在临床应用的产品来看,CRISPR技术和传统的成熟PCR相比还未显现明显优势,PCR的最低检出限和检测速度甚至可以超越CRISPR。一个新技术需要一定时间的成熟和发展,也需要越来越多的临床应用反馈来改进,因此,随着提取技术、等温扩增技术的应用以及更新更好的Cas蛋白的发现,CRISPR技术是否能超越传统PCR,是否如发表文献所说的有专属的应用场景还有待观察。现批准上市的产品有:新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(恒温CRISPR法)、新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(CRISPR免疫层析法)等。

  六、 基于微流控技术的检测技术

  微流控(Microfluidics),是一种精确控制和操控微尺度流体,尤其特指亚微米结构的技术,又称其为芯片实验室(Lab-on-a-Chip)或微流控芯片技术。是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上,自动完成分析全过程。微流控芯片技术应用于核酸分子检测,可以将核酸提取、扩增及检测等基本操作单元集成到一块几平方厘米大小的芯片上,实现核酸分子的自动化检测。随着微流控芯片技术在临床检验诊断中的应用和发展,基于核酸分子检测的微流控产品也开始占领了部分市场。Cepheid公司在2005年发布的GeneXpertPCR分析仪,是世界上第一个将样品制备、扩增与检测完全整合的定量PCR(聚合酶链式反应)仪,使得不具备专业技术的人员也可以在各种环境下进行复杂的分子检测,同时基于实时荧光定量PCR技术,可以在30min内完成检测。Cepheid公司单个芯片只能进行单个项目的检测,而GenePoc的Revogene系统以及博晖创新的GenPlexTM微流控全自动核酸检测系统将芯片设计成离心及阵列式微流控芯片,在单一芯片上可以进行多个项目的检测。现批准上市的产品有:赛沛的结核分枝杆菌和利福平耐药基因检测试剂盒(实时荧光PCR-熔解曲线法)、博奥晶芯的二十三项遗传性耳聋相关基因检测试剂盒(微流控芯片法)、卡尤迪的新型冠状病毒2019-nCoV 核酸检测试剂盒(荧光PCR法)、东方知微的新型冠状病毒(2019-nCoV)及甲/乙型流感病毒核酸联合检测试剂盒(荧光PCR法)等。

  本文前五种检测技术是基于核酸检测方法学的分类,最后一种检测技术时基于流体控制及自动化生成的检测平台新应用。各检测技术在临床应用中都有各有特点,均已在临床成功转化应用。随着我国人口老龄化的进程,癌症、慢性病等发病率会持续升高,同时国民健康意识也在逐渐提升。分子诊断技术将呈现快速且自动化趋势,以减少人工消耗、降低成本、缩短检测周期,以便更好地在临床应用。

器械大湾区分中心 刘美林 王丰 供稿

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