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发布时间：2021-02-18
版权归属原文（原创 2021-02-10 CMDE 中国器审）
引言
自2019年新型冠状病毒（以下简称新冠）被发现以来，新冠疫情在全世界持续蔓延，全球感染例数不断攀升。为有效应对疫情，世界各国都在加紧新冠疫苗的研发，到目前为止，美国、英国、中国、欧盟等国家和地区，已相继批准多个疫苗用于人群接种。
在疫苗临床有效性的评价中，疫苗保护效力（即评价接种疫苗后所预防疾病的发病率下降百分比）是最为关键的评价指标。同时，中和抗体的检测对于评价疫苗接种后人体免疫应答水平等也起到非常重要的作用。这里所说的中和抗体检测主要指基于体外培养病毒进行的中和试验。
伴随着疫苗的研究和上市，多家研究机构和生产企业致力于采用体外诊断试剂进行中和抗体检测的研究，且预期用途与疫苗有效性评价有关。体外诊断试剂能否进行中和抗体检测，能否用于疫苗效果评价等相关问题引发了行业高度的关注和讨论。我中心针对这一问题进行了多次调查研究，并召开专家研讨会，征求相关行业专家意见。参与讨论的专家包括了疫苗研发、疫苗评价、中和抗体试验研究和评价、临床医生、传染病预防控制、临床检验等各个相关领域的专家。现将目前调研结果总结如下。
一、新冠中和抗体的作用机制及主要类型
中和抗体是由病毒最外层的包膜或衣壳抗原刺激机体产生的一类能与病毒结合并使之丧失感染力的抗体。病毒侵入人体后，体内浆细胞会产生病毒特异性抗体，其中只有一部分是中和抗体。
中和抗体作用机制一般包括改变病毒表面构型；与吸附有关的病毒表位结合，阻止病毒吸附，使病毒不能侵入细胞进行增殖；与病毒形成免疫复合物，易被巨噬细胞吞噬清除；有包膜病毒的表面抗原与中和抗体结合后，激活补体，可导致病毒的溶解。
目前针对新冠病毒的中和抗体是研究的热点，不同的研究小组应用各种筛选方法筛选出大量针对新冠病毒的中和抗体，这些抗体大致可以分为以下几类：
1.针对S1蛋白的受体结合域（RBD）
针对S1蛋白RBD的中和抗体可以与新冠病毒RBD区域结合，阻断RBD与ACE2受体结合，从而阻断病毒侵入人体细胞。针对RBD的中和抗体是人体产生的最主要、种类最多、对病毒阻断活性最高的一类抗体。
2.针对S1蛋白的N末端域（NTD）
有些中和抗体针对S1蛋白NTD区域，比如4A8等，能有效地中和新冠病毒。2021年1月发表于Cell Research的一项研究显示，人体细胞上的酪氨酸蛋白激酶受体UFO（AXL）与NTD区域特异性结合，可能是潜在的病毒感染细胞的受体，此项研究结论可以部分解释NTD中和抗体能够有效中和新冠病毒的原理。
3.其他
有研究报道了多株针对S1蛋白的中和抗体，但不能与RBD重组蛋白结合，也不识别NTD结构域，其中和机制还有待进一步研究。另有研究表明新冠肺炎康复者血浆存在能结合S2蛋白的抗体，相关研究报道较少。
综上，中和抗体阻断病毒感染可有多种途径；目前的研究证实，针对新冠病毒的中和抗体可能的结合位点涉及多个蛋白结构域，且不排除还有新的未被发现的结合位点。
二、中和抗体检测的“金标准”
中和抗体检测是疫苗研发和临床评价过程中重要的指标之一，中和抗体检测的实验室金标准是感染抑制试验，主要包括利用活病毒进行的蚀斑减少中和试验（plaque reduction neutralization test，PRNT）和通过检测细胞病变（cytopathic effect，CPE）量来进行分析的微量细胞中和试验。这两种方法均使用定量的活病毒与不同稀释度的等量血清混合后，接种预先准备好的单层细胞，通过不同的指标评价细胞的病变程度评价中和抗体效价。采用体外培养的活病毒进行的中和试验反映的是人体血液样本中能够阻断病毒感染的总中和抗体的效价。
中和抗体检测方法需要经过严格的标准化过程和充分的性能评价，并通过确定适合的判断界值（Cut-off值），建立与病毒保护力之间的相关性，确定最低保护水平。例如已经较为成熟的流感疫苗、EV71疫苗、狂犬病疫苗、脊髓灰质炎疫苗等，均已建立了WHO认可的标准化的中和抗体试验，有相应的WHO标准品和推荐使用的标准毒株，并设定了明确的Cut-off值。其他疫苗，即使尚没有国际公认的参考方法，各疫苗厂商也需要建立相对标准化的中和抗体试验方法。
此外，对于新发突发烈性病毒性传染病来讲，由于活病毒株来源以及需在高等级生物安全实验室操作的限制，越来越多的实验室开始研发假病毒细胞培养的方法检测中和抗体，该方法中假病毒的膜蛋白结构与活病毒相似，且不需要高等级生物安全实验室，操作简便，结果判断客观；但该方法同样需要标准化且应与活病毒培养的方法进行验证。
专家广泛认为，以上PRNT、CPE和假病毒中和试验是病毒疫苗评价中最常用且最经典的三种中和抗体检测方法。方法学可靠，但需严格的标准化过程。
针对新冠病毒，国内外多个研究机构和生产企业都在致力于研究基于活病毒或假病毒的中和抗体检测方法，其中也包括WHO的专业实验室，但由于新冠疫苗研发的周期较为有限，相关基础研究仍然不够，加之突变株的不断出现，到目前为止还没有建立起标准化的中和抗体试验方法；各家机构建立的试验方法之间也存在不小的差异。
三、基于酶联免疫等方法的中和抗体检测试剂研发情况
目前，国内外很多科研机构和企业将中和抗体检测试剂作为研发方向，进行了很多探索。一般是基于单抗原表位或多抗原表位采用竞争抑制原理的酶联免疫法进行中和抗体检测。产品拟定预期用途与疫苗接种后有效性评价有关。
针对此类产品的研发和临床定位尚存在以下主要问题：
1.试剂需要选择一个或多个抗原表位进行中和抗体检测，而抗原表位的选择决定了检测到的抗体是否中和抗体，以及能够起到保护作用的中和抗体是否都被充分检测到了。目前新冠病毒的基础研究尚不充分，中和抗体可能涉及病毒表面的多个蛋白结构域；且有研究表明在疫苗接种后的不同时间阶段，中和抗体谱可能会发生变化，例如中和抗体中RBD抗体和NTD抗体的比例可能发生变化；同时病毒抗原表位的变异频频出现，且规律尚不明确。因此，无论是单个表位还是多个表位的检测产品，均不能确保覆盖所有中和抗体。且不同的疫苗在工艺路线上的差异，导致产生的中和抗体也不同，这些差异带来的不确定性使得试剂在中和抗体表位的选择上很难达到很好的代表性和覆盖程度。
2.体外检测中和抗体的浓度值与疫苗保护效力的相关性尚缺乏充分的临床证据，无法建立可靠的Cut-off值。在没有可靠的Cut-off值的情况下，试剂检测结果很难用于描述疫苗的保护力，不能给临床提供有明确价值的判断和结果提示，即阳性不代表一定有保护力，而阴性或弱阳性也不能说明一定没有保护力。
现阶段已经有一些正在研究的项目，试图采用建立的体外诊断试剂与体外培养活病毒的中和试验进行对比研究，从而建立一个有效的Cut-off值，确立体外诊断试剂检测中和抗体的性能。但是，此类研究中所采用的对照方法“体外培养病毒的中和试验”尚且没有建立公认的标准化方法，因此比较研究的结论缺乏可溯源和可协调一致的基础。
可见基于现阶段的研究情况，体外诊断试剂检测中和抗体无论是在方法学的标准化方面还是Cut-off值建立方面都缺乏充分的研究和论证。
3.体液免疫并不是疫苗接种后产生保护力的唯一途径，除了中和抗体（体液免疫）之外，细胞免疫等其他免疫途径也同时发挥作用。因此接种疫苗后中和抗体滴度水平低或者检测阴性，并不能明确得出没有保护力的结论。对疫苗保护力的评价应结合体液免疫与细胞免疫等进行综合判断。
4.疫苗评价是从群体的角度判断能否实现一定的保护率，从传染病防控的角度证明疫苗能够有效阻断病毒的传播，而不是针对每一个个体判断疫苗是否有效。保护力的研究结论来自疫苗上市前及上市后大规模的临床研究数据。因此在没有充分数据支持、且新冠疫苗免疫机理研究及中和抗体中和机制研究尚不透彻的情况下，针对疫苗接种个体进行中和抗体检测，既不能给疫苗评价提供有效的支持，也不能给接种者个体提供有效的信息，不具备显著的必要性。
四、小结
综上，在疫苗研发和有效性评价的过程中，各种中和抗体检测替代方法的科学研究值得鼓励；但是，作为体外诊断试剂管理的产品上市，应当建立在充分的基础研究成果和充分的临床证据的基础上，应当符合法规规定的定义和用途。
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