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发布时间：2022-05-19
版权归属原文（原创 2022-05-19 CMDE 中国器审）
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD）广泛存在于各种生物体内，它是糖酵解磷酸戊糖旁路中的一个关键酶和限速酶，其主要的功能是产生NADPH。NADPH对于维持细胞的正常生理功能和形态具有极为重要的作用。当其缺乏时，红细胞极易受到氧化损伤，出现溶血性疾病，表现为黄疸甚至出现核黄疸。蚕豆病是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症患者在进食蚕豆或蚕豆制品后所引发的急性血管内溶血性贫血，临床表现为皮肤、巩膜黄染，有些病例出现血红蛋白尿，有些则有肝肿大现象。蚕豆病多发于幼儿及儿童，以男性多见。G6PD基因突变是导致该基因缺乏的主要原因，G6PD基因定位于Xq28，由13个外显子和12个内含子组成，编码515个氨基酸。G6PD缺乏症属于X连锁不完全显性遗传，早期的诊断和预防具有重大意义。
一、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶常用检测方法
目前，G6PD常用检测方法包括酶学和基因检测两大类，酶学检测法包括葡萄糖-6-磷酸底物法、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶G6PD/6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase 6PGD)比值法、高铁血红蛋白还原法、荧光斑点法等；常规基因检测法包括等位基因特异性扩增(ARMS)、等位基因寡核苷酸探针杂交(ASO)、错配碱基聚合酶链反应/限制性内切酶图谱分析等。
二、目前已批准葡萄糖-6-磷酸脱氢酶产品概况
目前已上市葡萄糖-6-磷酸脱氢酶检测产品包括检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变情况的基因检测法以及检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶含量及活性的酶学检测法。样本类型包括血清、全血、新生儿足跟血滤纸干血片等多种类型。
1.基因检测方法
已上市基因检测产品的方法学包括荧光PCR熔解曲线法、PCR-反向点杂交法等，用于体外定性检测人外周血基因组DNA中的中国人群常见的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变。
2.酶学检测方法
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶酶活性检测方法具有操作简单、方便快捷、价格低廉等诸多优点，已在临床诊断中被广泛应用。已上市酶学检测产品的方法学多为葡萄糖-6-磷酸底物法。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在NADP（氧化型辅酶Ⅱ）存在条件下催化6-磷酸葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖醛酸和NADPH（还原型辅酶Ⅱ）。在340nm处测定NADPH的生成速率，即可检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性。此外还有比值法检测试剂，试剂A液用于检测G6PD活性，B液用于检测6PGD活性，两者分别在不同的通道内检测，采用速率法分别检测红细胞中G6PD与6PGD的活性，反应原理均为催化其相应的底物反应，同时将NADP还原为NADPH，通过监测340nm处吸光度上升的速率即可计算两者的活性，再计算两者的比值，进而判断G6PD是否缺乏。
三、国际葡萄糖-6-磷酸脱氢酶检测试剂监管概况
WHO于2016年10月发布了《葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性检测体外诊断试剂指导原则》，该指南根据性别和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性将人群划分为正常、缺陷和中介（如表1）。现将该指南对分析性能评估的要求概述如下。
表1 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性划分
1.适用样本类型
（1）证明样本类型的等效性
至少选用25个葡萄糖-6-磷酸脱氢酶正常样本、25个中介样本和25个缺陷样本，证明每种声称样本类型的等效性。
（2）证明声称抗凝剂的等效性
至少选用25个葡萄糖-6-磷酸脱氢酶正常样本、25个中介样本和25个缺陷样本，证明每种声称抗凝剂的等效性。
2.样本收集、储存和运输
样本稳定性研究应考虑到储存条件（不同温度下的持续时间、湿度变化、温度限制、冻融循环），运输条件（如适用），样本采集和/或转移装置（包括干血斑滤纸）是否含有抗凝剂、是否可以密封。
3.精密度
重复性和再现性试验都应根据预期用途选用至少1个葡萄糖-6-磷酸脱氢酶正常样本、1个中介样本和1个缺陷样本。所选样本应确保在关键决策点附近、具有良好的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性代表性。必须证明关键决策点附近样本的精密度。每个测试样本应采用三批试剂，进行5个重复，运行3-5次，选择3个不同的试验地点，酶学方法还应选用2个温度。
4.分析灵敏度
（1）最低检出限
选择至少8个样本进行最低检出限研究，每个浓度至少检测15次。将95%检出率的最低酶活性作为最低检出限。所检测样本的酶活性应采用合适的生物学参考物质以及合适的参考方法进行校正。
（2）关键决策点性能验证
必须验证试剂区分葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的能力（如正常、缺陷、中介）。
可以采用不同比例混合葡萄糖-6-磷酸脱氢酶正常和缺陷样本来实现，获得广泛的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性，从而了解决策点（即缺陷/中介/正常）的性能。应测试至少三对单独试样的混合物。
（3）测量范围和相关性
定量检测试剂必须采用经合适生物学参考物质以及合适参考方法进行校正的、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性已知的样本进行测量范围研究。对已知G6PD活性样本的平行试验结果进行适当的统计分析，还应确定定量与适当参考试验的相关性程度。
对于报告血红蛋白浓度或将血红蛋白浓度标准化作为报告结果的一部分的试剂，还必须确定测定血红蛋白浓度的定量测量范围和相关程度。
5.分析特异性
特异性研究必须研究假正常或假缺陷结果的可能性，研究可采用自然或人工样本进行。内源性干扰物质包括：总胆固醇，血脂、胆红素和蛋白质升高样本，乳酸，乳酸脱氢酶，含铜化合物如氯化铜、硫酸铜，异常高值（54-65%）和异常低值（17-18%），血球压积，网织红细胞，白细胞和血小板升高样本，疟疾，甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎，艾滋病毒，肺炎，伤寒，镰状细胞贫血，变异血红蛋白（A、D、E、S、C），贫血，血红蛋白病，缺铁，白血病和/或其他红细胞疾病，糖尿病。外源性干扰物质包括相关药物，如抗寄生虫、抗疟疾、抗逆转录病毒和抗结核药物、普通非处方抗炎药物（阿司匹林、扑热息痛、布洛芬）、乙醇、咖啡因和某些类固醇（醛固酮相关）。
四、对我国葡萄糖-6-磷酸脱氢酶检测试剂审评的思考
目前已有相关产品在国内上市，部分处于研发或计划申报阶段。此类产品对人体样本中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶进行检测，临床上主要用于遗传性红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的辅助诊断，产品临床风险较高。企业在产品研发过程中对产品的认识程度不一，在参考品设置、分析性能评估等方面存在较多问题，有必要对这些共性问题进行总结规范，为申报企业从产品研发、生产至注册申报阶段提供更为全面的指导，为技术审评提供参考依据。
参考文献：
[1] WHO.In vitro diagnostic medical devices to identify phosphate dehydrogenase Glucose-6-(G6PD) activity.2016.10.
[2] 新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症筛查与诊断实验室检测技术专家共识.邹琳中华检验医学杂志2019年3月第42卷第3期.
审评六部 焦童 供稿
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